Résumé selectionné

Le transfert rétroviral du gène suicide de la thymidine kinase d'Herpes-simplex (HSV-TK) suivi d'un traitement par le ganciclovir (GCV) induit une réponse anti-tumorale sélective. Une des étapes limitantes de la thérapie génique par des vecteurs rétroviraux est l'intégration du transgène dans le génome de la cellule cible. Cette intégration dépend du cycle cellulaire. L'objectif de ce travail était d'augmenter l'efficacité du transfert rétroviral du gène HSV-TK dans des cellules tumorales coliques par le bloquage pharmacologique réversible de leur cycle cellulaire.

Les cellules tumorales coliques DHDK12 ont été synchronisées, en phase S, par le méthotrexate. Les cellules synchronisées (Sy) et témoins non synchronisées (T) ont été transduites par les vecteurs rétroviraux pTG 5391 (&bgr;-gal) et pTG 9344 (HSV-TK). Pour valider l'effet de la synchronisation sur l'efficacité des vecteurs rétroviraux, l'expression des transgènes a été caractérisée par cytométrie en flux selon 3 approches quantitatives

l'immuno-détection de la thymidine kinase par des anticorps monoclonaux ; la recherche de l'accumulation intra-cellulaire de substrats marqués. Le fluorescéine-di-&bgr;-D-galactopyranoside (FDG) constituait le substrat de la &bgr;-galactosidase. Le GCV a été marqué par un dérivé biotinylé de faible masse moléculaire qui, après phosphorylation du GCV par la thymidine kinase virale, était détectée par l'extravidine-FITC ; l'étude de l'apoptose par fixation membranaire de l'annexine V après 72 h de traitement par le GCV.

Le marquage par l'anticorps monoclonal et le signal produit par l'accumulation intracellulaire du GCV biotinylé étaient spécifiques des cellules exprimant HSV-TK. Après synchronisation, l'utilisation du FDG a permis de montrer un doublement du taux de transduction des cellules tumorales par le vecteur pTG 5391 (Sy : 26 % vs T : 11 %). Cette amplification de l'expression de &bgr;-gal était corrélée à la cinétique du cycle cellulaire. Les résultats étaient similaires après transduction par le vecteur pTG 9344. L'expression de HSV-TK était augmentée dans les cellules synchronisées. L'analyse quantitative de la thymidine kinase et de son activité devait être interprétée en fonction des modifications cellulaires liées au traitement par le méthotrexate. L'augmentation du marquage spécifique par l'annexine V (Sy : 46 % vs T : 23 %) traduisait une intensification de l'apoptose induite par le GCV sur les populations cellulaires transduites par HSV-TK après synchronisation.

La synchronisation en phase S augmente l'efficacité de la transduction de cellules tumorales coliques par des vecteurs rétroviraux. Cette optimisation du transfert de HSV-TK se traduit par une intensification majeure de l'apoptose induite par le GCV. In vivo, le conditionnement des cellules cibles par de faibles doses de méthotrexate pourrait contribuer à une réponse anti-tumorale complète après transfert rétroviral d'un gène suicide.