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P206 - L’hypoxie active les cellules étoilées du pancréas (PSC) : mise au point du premier modèle de culture de tranches épaisses de pancréas humain normal

Rebours Vinciane, Albuquerque Miguel, Lévy Philippe, Ruszniewski Philippe, Sauvanet Alain, Paradis Valerie, Bedossa Pierre, Couvelard Anne
Introduction

Les cellules étoilées du pancréas sont impliquées dans l'instauration de la fibrose au cours de la pancréatite chronique et favorisent l'oncogenèse dans le cancer du pancréas par la modulation de la matrice extracellulaire, de la prolifération, de la phagocytose et de la migration cellulaires. Leur activation est induite par la sécrétion de cytokines et de facteurs de croissance. Cependant leur rôle dans les phases précoces d'hypoxie et de stress oxydatif, fréquentes au cours de la pancréatite aiguë, n'est pas connu. But : Evaluer l'activation précoce des cellules étoilées du pancréas dans des conditions d'hypoxie sur du tissu pancréatique humain normal.

Matériels et Méthodes

Un modèle de culture de coupes épaisses de pancréas humain a été développé et validé. Des tranches de pancréas frais de 300µm étaient réalisées à partir de pièces opératoires (temps d'ischémie<2heures) et mise en culture dans des mieux adaptés en hyperoxie (95% O2). La moitié des prélèvements subissaient une phase initiale de culture en normoxie (21% O2) pour reproduire des séquences d'hypoxie. La durée totale de culture était de 72 heures. La viabilité cellulaire était contrôlée par des tests MTT toutes les 24 heures. Trois voies d'expression moléculaire étaient analysées : a/ hypoxie (HIF et CA9, apoptose cellulaire (caspase 3) ), b/ prolifération cellulaire (Ki67) et c/ activation (actine muscle lisse) des cellules étoilées.

Résultats

30 sections par spécimen étaient mises en culture dont 50% subissaient des conditions d'hypoxie. Chaque condition était étudiée en triplicat. L'analyse des coupes après coloration H&E et immunohistochimie (IHC) était réalisée à H0, 24h, 48h et 72h. L'analyse morphologique montrait l'apparition progressive d'une dédifférenciation ducto-acinaire. A 72h, des foyers de nécrose isolés et des noyaux picnotiques étaient identifiés. En IHC, l'hypoxie était confirmée par l'expression de Hif1 et CA9 dès 48h (10% à 50% des cellules marquées en foyers). L'apoptose était limitée, de rares cellules acineuses exprimaient la caspase 3 à 48h et 72h.L'analyse de la prolifération par l'Ac Ki67 montrait une positivité croissante des cellules étoilées du pancréas périacinaires significative à 48h (x5/ état basal) et 72h (x6/état basal). L'activation des PSC était confirmée par la positivité de l'actine muscle lisse, qui soulignait un nombre augmenté de PSC par champ à 24h et 48h. Les remaniements de la matrice extracellulaire dès 48h étaient confirmés par une positivité de la laminine dans les zones périnécrotiques.

Conclusion

La culture de tranches de pancréas normal d'origine humaine est possible grâce à ce modèle avec une viabilité cellulaire optimisée à 72heures. Il permet de maintenir l'hétérogénéité tissulaire et les relations cellules-matrice extracellulaire. L'hypoxie induit très précocement, dès 48h, l'activation des cellules étoilées du pancréas, qui jouent un rôle clé dans la fibrose et l'oncogenèse pancréatiques. Notre modèle suggère donc que l'inflammation est mise en jeu très précocement après chaque événement de stress cellulaire comme au cours de la pancréatite aiguë et peut ainsi participer aux phases précoces de l'oncogenèse.